Spindelsilke och dess mekaniska egenskaper har länge studerats och är idag väl karaktäriserade. Att utvinna spindelsilke ifrån spindlar är komplicerat, därför har en metod att framställa spindelsilkesprotein (4RepCT) med hjälp av rekombinant DNA-teknik utvecklats. 4RepCT är förenlig med levande celler och kan användas som stödmatris för cellodlingar. Fibronektin, (FN) är ett glykoprotein som finns i det extracellulära matrixen och uppvisar peptider som gynnar celladherens. På genetisk väg kan 4RepCT kopplas med en sådan peptid ifrån FN (FN-4RepCT). Vaskulär endoteltillväxtfaktorreceptor 2 (VEGFR-2) uttrycks på endotelceller och aktiveras av VEGF-tillväxtfaktor. Denna aktivering kan initiera tillväxt av redan existerande blodkärl såsom vid cancersjukdomar. VEGFR-2 är således en attraktiv och lovande måltavla för framtida behandling av cancerpatienter. Under projektet användes transgena celler, 293/KDR som överuttrycker VEGFR-2.

Syftet med examensarbetet var att undersöka funktionaliteten och bioaktiviteten hos VEGFR-2-bindande affibody-molekyler efter deras konjugering till 4RepCT och FN-4RepCT.

Alamar Blue och immunokemiska tekniken ELISA användes för att undersöka cellproliferation/viabilitet respektive fosforylering. Cellproliferation av 293/KDR undersöktes i brunnar täckta med först 4RepCT och sedan följt utav affibody molekylerna: Zdimer-4RepCT, Ztetramer-4RepCT, FN-4RepCT, Zdimer-FN-4RepCT, Ztetramer-FN-4RepCT och 4RepCT. För att undersöka fosforyleringseffekten av affibody molekyler på 293/KDRs VEGFR-2 användes ELISA.

Högst proliferationsvärde erhölls från 293/KDR odlade på Ztetramer-FN-4RepCT. Brunnar täckta först med 4RepCT och sedan Zdimer-FN-4RepCT uppvisade en lägre cellproliferationskapacitet än Ztetramer-FN-4RepCT. VEGFR-2 fosforyleringsresultaten visade att affibody-molekylen Ztetramer-4RepCT har en större effekt på VEGFR-2 jämfört med Zdimer-4RepCT. Slutsatsen drogs att Ztetramer kopplad till 4RepCT med eller utan FN visar en stimulerande effekt på VEGFR-2 fosforylering dock behöver ytterligare studier genomföras.

Spider silk and its mechanical properties are today well-recognized. Obtaining sufficient amount of spider silk from spiders is complicated, therefore a method to produce recombinant spider silk fusion protein (4RepCT) has been developed. 4RepCT has biocompatible properties and can be used as a scaffold for cell cultures. Fibronectin, (FN) is a glycoprotein found in the extracellular matrix containing peptides that stimulate cell adherence. 4RepCT can be genetically coupled to a FN-peptide (FN-4RepCT). The vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2) is found on endothelial cell which are activated by VEGF-polypeptides. This initiates growth of existing blood vessels which can be observed in cancerous diseases and therefore VEGFR-2 is an attractive and promising target in cancer research. During this study transgenic cells that overexpress VEGFR-2, 293/KDR were used.

The aim of the study is to examine the functionality and bioactivity of VEGFR-2-binding affibody molecules after their conjugation with 4RepCT and FN-4RepCT.

Alamar Blue and the biochemical assay ELISA were used to examine cell proliferation/viability and phosphorylation respectively. Cell proliferation of 293/KDR was analyzed in wells coated initially with 4RepCT followed by one extra coating of the following affibody molecules: Zdimer-4RepCT, Ztetramer-4RepCT, FN-4RepCT, ZDimer-FN, Ztetramer-FN-4RepCT and 4RepCT. Phosphorylation was examined of 293/KDRs VEGFR-2 cultures on the mentioned coatings using ELISA.

293/KDRs highest proliferation value was obtained on Ztetramer-FN-4RepCT. Zdimer-FN-4RepCT had a lower cell proliferation than Ztetramer-FN-4RepCT. The phosphorylation results showed that the affibody-molecule Ztetramer-4RepCT has a stronger effect on VEGFR-2 in comparison to the Zdimer-4RepCT. The conclusion was drawn that Ztetramer coupled to 4RepCT with or without FN may impose an inducive effect upon VEGFR-2 although further studies need to be conducted.