Buprenorfin och metadon är två opioider som bland annat används för att behandla opiatberoende. Genom att monitorera koncentrationen av metadon eller buprenorfin i serum går det att följa behandlingen, undvika toxicitet och säkerställa att patienterna tar sina tabletter. Vid sektionen för kromatografiska specialanalyser på Klinisk kemi vid Sahlgrenska Universitetssjukhuset analyseras metadon i serum med en HPLC-UV-metod. Det har visat sig att substanser som bensodiazepiner kan störa kromatografin genom att eluera samtidigt med topparna för metadon eller metodens internstandard, trimipramin. Det ger svårigheter i att utvärdera svarsresultatet. Huvudsyftet med detta arbete var att utveckla en interferens-fri metod för att analysera metadon i serum med HPLC-UV. Andra målsättningar med arbetet var att undersöka om analys kunde utföras på mindre serumvolym, samt att undersöka om buprenorfin kunde läggas till i analysen. I arbetet undersöktes olika strategier för provupparbetning, vilket ledde till en ny provupparbetningsstrategi med 300 μL utgångsserum istället för 500 μL och en ny tvättfas vid fastfasextraktion, bestående av 60 % (v/v) 1:1 (v/v) acetonitril:metanol, i vatten. En relativt ny typ av analytisk kolonn med difenyl som analytisk fas testades och uppvisade bättre kromatografi än med C18-kromatografi.  Bäst separation på difenylkolonnen erhölls med 45 % (v/v) metanol, 0,1 % (v/v) myrsyra vid flödet 0,40 mL/min. För metadon har den utvecklade metoden med difenylkolonn på HPLC-UV ett inomserie-CV på 6,6 % (n=12). Serumprover spikade med nordiazepam och temazepam användes som ett modellsystem för interferenser vid metodutveckling. Serumprover från patienter där interfererande substanser tidigare har noterats användes för att testa den nya metoden.  Med den nya metoden interfererade inte nordiazepam eller temazepam vid analys av metadon i serum, och patientprover som innan störts av interferenser verkade nu helt interferensfria. Buprenorfin visade sig inte vara lämplig för analys med HPLC-UV då känsligheten var för låg. Försök med masspektrometri som detektion indikerar att LC-MS/MS möjligen kan vara ett alternativ då metoden uppvisar högre känslighet än HPLC-UV.